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蜂蜜中糖含量分析方法的確定及問題分析

更新時間:2017-03-07      點(diǎn)擊次數(shù):4218

測定蜂蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖

適用于該項(xiàng)目的國標(biāo)有GB/T 22221-2008GB/T18932.22-2003, 實(shí)驗(yàn)室沒有GB/T18932.22-2003標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的色譜柱,而GB/T 22221-2008標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的條件都能滿足,就先按照GB/T 22221-2008標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行樣品前處理和儀器分析。

 

2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1儀器及試劑
Waters e2695液相色譜儀、2414示差折光檢測器;果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖均為分析純;乙腈,色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為Millpore超純水系統(tǒng)制得,18MΩ•cm,25
2.2儀器分析條件參照GB/T 22221-2008標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)定
色譜柱:CNW Athena NH2 (250mm×4.6mm, 5μm);流動相:乙腈:水=8515;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣體積:20μL;色譜柱溫度:40;檢測器溫度:40
2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
分別準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖用水溶解并定容至100mL,配成濃度為5g/100mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。
由于是條件摸索階段,因此不急于配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,先配制一個較高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1g/100mL)用于確定儀器分析條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。
3 遇到的問題與分析
3.1 儀器分析條件的優(yōu)化及單標(biāo)確認(rèn)
按照上述儀器分析方法對濃度為1g/100mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,測定結(jié)果見圖1

 

從圖中可以看出,雖然4種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中對應(yīng)出現(xiàn)4個色譜峰,但是卻存在以下幾個問題:
1 該色譜條件下4種組分的分離時間較長,4種組分*分離需要近35min,各組分之間的分離度較大,可以嘗試進(jìn)行條件優(yōu)化,縮短檢測時間;
2 相同濃度下4種組分的出峰響應(yīng)值相差較大,配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液時可以依據(jù)樣品中的含量適當(dāng)降低組分1或者增加其它組分的濃度;
3 基線噪音較大,不利于微量組分的分析,對樣品的定性和定量都會產(chǎn)生影響
針對上述問題,決定先嘗試優(yōu)化儀器分析條件,縮短樣品測試時間?;旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的濃度在色譜柱和儀器的耐受范圍內(nèi),由于是條件摸索階段,因此暫時先不調(diào)整,仍然采用該濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析。分析條件中采用的是示差檢測器,該檢測器不允許進(jìn)行梯度洗脫,要改善分離條件縮短測試時間只能從流動相上做文章,于是嘗試通過改變流動相比例進(jìn)行優(yōu)化。氨基色譜柱既可以用于正相模式反相模式,又可以用于反相模式,在正相模式下,可以代替硅膠柱使用;在反相模式下可用于碳水化合物的分析,尤其適用于糖類分析,本實(shí)驗(yàn)即是采用氨基色譜柱的反相模式進(jìn)行糖類分析。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)微調(diào)流動相中有機(jī)相的含量,各組分間的分離度有很大的變化。增加乙腈的比例能夠提高各組分間的分離度,但測試時間延長;降低乙腈的比例會降低各組分的分離度,但卻很大程度上縮短了測試時間。當(dāng)流動相為乙腈:水=7525時,4種糖的測定時間縮短至15 min,同時4種糖具有較好的分離度。

 

上述測試過程中使用的是4種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個峰對應(yīng)的待測組分還是未知的,因此在該儀器分析條件下先對各組分進(jìn)行單標(biāo)確認(rèn)。

 

 

在單標(biāo)確認(rèn)的過程中又發(fā)現(xiàn)以下幾個問題:
1 雖然混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中出現(xiàn)了4個*分離的色譜峰,但是對比單標(biāo)色譜圖發(fā)現(xiàn),每個單標(biāo)色譜圖中都出現(xiàn)了兩個峰, 4min附近色譜峰的峰面積和峰高幾乎 一致,很有可能是溶劑峰;
2 如果4min附近的色譜峰是溶劑峰,那么4種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖中實(shí)際上只分離出了3種組分,有一種組分沒有出峰或者與其他組分的保留時間接近;
3 對比葡萄糖和麥芽糖的單標(biāo)色譜圖發(fā)現(xiàn),兩者的保留時間*一致,可能是操作有誤,兩者組分在配制或在進(jìn)樣時弄錯了。
針對上述問題逐一進(jìn)行排查,由于所用的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液是用水配制和稀釋的,4min附近的色譜峰是否是溶劑峰只需進(jìn)一針?biāo)畼蛹纯桑虼耸紫纫约兯疄闃悠愤M(jìn)行進(jìn)樣測試,并且重新配制葡萄糖和麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液并測試,配制和進(jìn)樣過程及其仔細(xì)防止中間環(huán)節(jié)出錯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,4min附近的色譜峰為溶劑峰(見圖4),同時重新測定后葡萄糖和麥芽糖的保留時間仍然*一致。

 

 

葡萄糖和麥芽糖的保留時間一致,考慮是否是儀器分析方法不合適導(dǎo)致這兩種組份沒有分離?在前面的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),微調(diào)流動相比例4種糖的保留時間會有很明顯的變化,于是嘗試通過改變流動相的方式進(jìn)行分離,然而實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)改變流動相兩者的保留時間是同步變化的。實(shí)驗(yàn)遇阻,就去查資料。百度一下葡萄糖和麥芽糖基本信息和結(jié)構(gòu)(見圖5),兩者的分子式和結(jié)構(gòu)都有很大的差別。然后去查閱文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)采用氨基柱分離葡萄糖和麥芽糖的文獻(xiàn)并不少見??磥硎侨似放c技術(shù)的問題了。

難道是色譜柱的原因?色譜柱柱效下降導(dǎo)致兩者不能分離?于是更換新的色譜柱再次分離,結(jié)果還是沒有能夠?qū)烧叻蛛x。如果葡萄糖和麥芽糖無法分離,實(shí)驗(yàn)便無法進(jìn)行下去,在經(jīng)過上述嘗試之后將問題的矛頭指向了所用的試劑。查試劑臺賬,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室里還有其他品牌分析純的葡萄糖,而麥芽糖*一瓶,但是幸運(yùn)的是發(fā)現(xiàn)了葡萄糖和麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)品,決定使用麥芽糖和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)品試一下。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用分析純和標(biāo)準(zhǔn)品配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時間保持一致,而采用分析純和標(biāo)準(zhǔn)品配制的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的出峰時間出現(xiàn)了差異??偹闶强啾M甘來找到了問題的癥結(jié),看來這次是李逵遇到了李鬼。重新配制4種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用上述儀器分析條件進(jìn)行測定時4種糖得到了較好的分離,因此繼續(xù)延用上述的儀器分析條件進(jìn)行后續(xù)測定。
3.2 溶劑效應(yīng)的消除
4種糖的分離和確認(rèn)過程基本完成,接下來解決溶劑效應(yīng)的問題。溶劑效應(yīng)在液相分析中是一種很常見有時也是很讓人頭疼的現(xiàn)象,嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)可能會影響到分析結(jié)果。溶劑效應(yīng)產(chǎn)生的原因和處理方法早有前輩進(jìn)行過細(xì)致的講解(想了解更多可以參看帖子,這里也不過多的贅述。雖然此次的溶劑效應(yīng)不會影響定性和定量,但是那高高再上的溶劑峰看著很難受,于是想嘗試解決或者減輕溶劑效應(yīng),降低溶劑峰的峰響應(yīng)。為了減少分析時間,同時減少標(biāo)準(zhǔn)品的消耗(麥芽糖的標(biāo)準(zhǔn)品只有0.25g/瓶)決定直接用流動相中的兩相(乙腈和水)進(jìn)行嘗試。通過改變乙腈和水的體積比考察溶劑峰的出峰情況。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在上述色譜條件下以乙腈為樣品進(jìn)行測試時溶劑峰為響應(yīng)值很大的倒峰;以水為樣品進(jìn)行測試時溶劑峰為響應(yīng)值很大的正峰;調(diào)節(jié)兩者的比例可以改變?nèi)軇┓宓某龇迩闆r,如圖7。

 

從圖中可以看出, 試樣為70%乙腈和80%乙腈時溶劑峰已經(jīng)變小許多,而以流動相為樣品(75%乙腈)時溶劑效應(yīng)得到了進(jìn)一步的降低,也就是人們常說的,可以嘗試用流動相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液或者定容樣品減輕溶劑效應(yīng)。于是決定采用流動相配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,然而在配制過程中又遇到了難題,高濃度糖的水溶液與乙腈不能互溶,兩者會出現(xiàn)明顯的分層,如圖8(照片拍的不是很清楚,但是可以看到一個分界線)。真是一波還未平息,一波又來侵襲??磥聿捎昧鲃酉嗯渲茦?biāo)準(zhǔn)溶液的方式是行不通了,于是適當(dāng)提高水相的比例,當(dāng)采用50%乙腈水溶液時,兩相沒有出現(xiàn)分層,同時測定時有效地降低了溶劑效應(yīng),因此在后續(xù)的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和樣品前處理過程中均采用50%乙腈水溶液。

 

3.3 基線噪音的消除
優(yōu)化完儀器分析條件并解決了溶劑效應(yīng)問題之后,接下來就要解決基線噪音的問題了。液相中產(chǎn)生基線噪音的原因有:(1) 燈能量下降;(2)流通池污染;(3)泵壓不穩(wěn);(4)氣泡等。論壇中關(guān)于基線噪音的帖子也很多,許多老師都對基線噪音產(chǎn)生的原因和消除方法進(jìn)行過詳細(xì)的介紹,這里僅列舉一二

于是按圖索驥,依據(jù)論壇中介紹的消除基線噪音的方法分別對單向閥、色譜柱、樣品池和參比池等進(jìn)行維護(hù),然后再對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測試,結(jié)果都沒有能夠得到理想的色譜圖,基線噪音依舊很大??紤]到前期測定時流動相微調(diào)會對樣品出峰有很大影響,同時依據(jù)示差檢測器的檢測原理(示差檢測器是連續(xù)檢測樣品池和參比池間液體折光指數(shù)差值的檢測器),該檢測器對流動相的變化和溫度都很敏感,而實(shí)驗(yàn)中流動相都是通過比例閥在線混合的方式進(jìn)行的,在線混合不僅可能導(dǎo)致流動相組成會有微弱的差異,同時乙腈與水的在線混合也可能引起溫度的變化,因此嘗試采用流動相預(yù)先混合的方式,即按照在線混合優(yōu)化后的比例進(jìn)行預(yù)先配制流動相然后進(jìn)行測試,采用該方法后基線噪音得到明顯改善。關(guān)于基線噪音消除方法將另開一貼進(jìn)行詳細(xì)介紹。

3.4色譜柱的修復(fù)
經(jīng)過上述一系列的優(yōu)化和測試,蜂蜜中4種糖的測定方法基本確定,按照zui終優(yōu)化的方法進(jìn)行樣品前處理、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和分析測定。然而在后期的測試過程中發(fā)現(xiàn),氨基柱的性能下降很快,峰明顯變寬,柱效降低,如圖10。系統(tǒng)適應(yīng)性測試表明,經(jīng)過幾番測試后氨基柱的柱效只用新柱的約三分之一。
 

采用隨柱說明書(見圖11)提供的方法進(jìn)行維護(hù):先用20倍乙腈沖洗,接著用異丙醇過渡,然后用二氯甲烷沖洗色譜柱,zui后再用異丙醇過渡回來,用流動相沖洗、平衡色譜柱后進(jìn)樣分析,測試發(fā)現(xiàn)維護(hù)后色譜柱性能并沒有多大變化。

平時實(shí)驗(yàn)中C18色譜柱用的比較多,前期也對C18色譜柱進(jìn)行過修復(fù)實(shí)驗(yàn)并取得了很好的效果,此次也決定試一下。于是拆柱,拆開色譜柱后發(fā)現(xiàn)氨基柱的前端填料有點(diǎn)塌陷,于是從同款舊柱子的末端取了一些填料進(jìn)行填補(bǔ),同時對前端的篩板進(jìn)行了清洗,如圖12。經(jīng)過填料的修補(bǔ)和篩板的清洗,色譜柱的柱效略有提高,但是與新柱相比還是相差甚遠(yuǎn)。在液相色譜之家群中和各位老師交流以及后期的學(xué)習(xí)過程中了解到:氨基柱是在高純球形硅膠基質(zhì)上鍵合氨丙基團(tuán),采用氨基柱分析糖時通常會用到水相,而氨丙基團(tuán)遇水易水解,從而導(dǎo)致柱效下降。當(dāng)用到酸性流動相時,流動相pH值越低、流動相中水的比例越高越容易發(fā)生水解,這種損傷是不可逆的,會導(dǎo)致色譜柱的報(bào)廢。

4 小結(jié)
1)實(shí)驗(yàn)中之所以采用分析純的試劑配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液是因?yàn)榍捌诘臏?zhǔn)備工作做的不是很充分,儲備的標(biāo)準(zhǔn)品種類不全,同時標(biāo)準(zhǔn)品含量太少,不足以前期方法摸索階段的消耗,因此才會出現(xiàn)麥芽糖的李逵李鬼事件;
2)流動相在線混合的方式雖然會引起基線噪音,但是在前期方法摸索階段,對流動相進(jìn)行優(yōu)化時還是方便可行的,可以通過此方法摸索出合適的流動相比例后再采用預(yù)混的方法進(jìn)行測定;
3)此次氨基柱維護(hù)和修復(fù)的結(jié)果都不是很成功,但是使用過程中氨基柱性能下降的問題依然存在,對氨基柱更好的使用和維護(hù)方法還在摸索階段,其他版友如有良策歡迎共同探討。

 

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